Publicado por: Djalma Santos | 10 de julho de 2011

DNA: depósito das informações genéticas

Conquanto a hipótese de que os genes eram feitos de proteínas (“código proteico”) fosse bastante aceita na primeira metade do século passado, não havia uma evidência experimental sólida que apoiasse essa ideia. A necessidade da identificação experimental do material genético cresceu bastante a partir da década de 1930, quando se tornou evidente que o DNA, a exemplo das proteínas, era um longo polímero e poderia existir em um número quase infinito de formas variáveis e, ainda, que os veículos moleculares da hereditariedade se encontravam nos cromossomos. Lembramos que o termo cromossomo (“corpo colorido”) foi inicialmente usado em 1888 para descrever estruturas densamente coráveis, observadas em células eucarióticas durante a metáfase. Nos anos de 1920, Robert Feulgen desenvolveu um corante púrpura DNA-específico (reativo de Feulgen) que corava as células pela presença de DNA. Esse corante foi utilizado para demonstrar que o DNA se localizava nos cromossomos, tanto de células somáticas como germinativas. Apesar de ele ainda ser usado, muitos outros métodos adicionais e corantes se encontram hoje em dia à disposição dos pesquisadores, para a “visualização” do DNA. Ressaltamos que os métodos disponíveis, inicialmente, para extração dos cromossomos dificultavam a obtenção de preparações purificadas. Apesar disso, era evidente que eles eram quase que exclusivamente compostos de DNA e proteínas. As análises iniciais dos cromossomos isolados demonstraram, também, que a quantidade de DNA excedia, em muito, a quantidade de proteína. Apesar dessa diferença, a comparação relativamente simples do DNA em relação às proteínas, resultou em divisão da opinião científica até cerca dos anos 1930. Essa diferença comparativa deu crédito à existência de uma “proteína genética” nos cromossomos, fazendo pensar que o código era proteico e não genético, como mencionamos acima. Hoje se sabe que as proteínas co-purificadas com DNA cromossômico desempenham, na verdade, papéis importantes, tais como o empacotamento do DNA no interior do núcleo e a proteção do material genético contra agentes agressores.

Se tanto o DNA quanto a proteína satisfaziam, em princípio, a necessidade fundamental do material genético, e ambos estão presentes nos cromossomos, sabidamente carregador das informações genéticas, de que eram feitos realmente os genes? Duas séries de experimentos, diferentes em sua proposição, conduziram, finalmente, à elucidação de que o material genético era o DNA e não a proteína, estabelecendo, dessa forma, a natureza bioquímica dos fatores hereditários. O primeiro desses experimentos, mostrados a seguir, como primeira evidência, foi a identificação da natureza química do princípio transformante, substância dotada da capacidade de alterar, permanentemente, a natureza genética da bactéria Streptococcus pneumoniae (classificada na época como Diplococcus pneumoniae), causadora de pneumonia em mamíferos, inclusive nos seres humanos. A segunda evidência, também mostrada adiante, resultou de trabalhos realizados por Alfred Day Hershey e Martha Chase em 1952, estudando a infecção bacteriana por um bacteriófago. Para isto, eles usaram fósforo radioativo (32P) e enxofre radioativo (35S) para marca, respectivamente, o DNA e a capa proteica do bacteriófago infectante. Essas duas séries de experimentos, determinando efetivamente que a informação genética é codificada e transmitida pelo DNA, foram decisivas para o desenvolvimento da moderna genética molecular.

I. PRIMEIRA EVIDÊNCIA EXPERIMENTAL (PRINCÍPIO TRANSFORMANTE)

Apesar dos ácidos nucleicos terem sido descobertos em 1868, pelo químico suíço Johann Frederick Miescher estudando núcleo de células purulentas obtidas de bandagens cirúrgicas descartadas, a primeira evidência direta de que o DNA era o material genético só surgiu em 1944, graças aos trabalhos realizados por Oswald T. Avery, Colin M. MacLeod e Maclyn McCarty, no Instituto Rockefeller, nos EUA.  Esses pesquisadores mostraram que o DNA extraído de uma variedade “virulenta” (causadora de doença) da Diplococcus pneumoniae transformava, geneticamente, uma linhagem “não virulenta” (não patogênica) desse organismo, em uma forma “virulenta” (patogênica). As principais etapas da pesquisa que conduziram a essa conclusão estão mostradas, resumidamente, na figura abaixo. Em 1928, o microbiologista inglês Fred Griffith, do Ministério da Saúde britânico, estudando a patogenicidade da Diplococcus pneumoniae, mostrou que a variedade capsulada (lisa), envolvida por uma cápsula de muco, de aparência suave e brilhante, daí sua designação de forma “S” (do inglês, “smooth” = lisa) era patogênica, matava os camundongos ao cabo de poucos dias. A linhagem não capsulada, desprovida do envoltório mucoso, de aspecto rugoso, designada de forma “R” (do inglês, “rough” = rugosa), ao contrário, era não patogênicas, não causava pneumonia; o animal permanecia saudável. A presença do envoltório mucoso na variedade “S” impede o sistema imunológico do animal de reconhecer o invasor. As células “R”, por outro lado, não possuindo esse envoltório são imediatamente atacadas pelas defesas imunológicas do camundongo. Ressaltamos que a capacidade de produzir ou não cápsula, portanto, patogênica ou não patogênica, é um caráter hereditário, ou seja, bactérias capsuladas ou não, ao se reproduzirem, sempre produzem outras iguais a elas, exceto, evidentemente, se ocorrer mutação. Griffith constatou, ainda, que bactérias capsuladas mortas pelo calor (60oC durante 3 horas) perdiam sua virulência; os camundongos continuavam saudáveis. Resultado esperado, pois, embora as bactérias tipo S (lisas) sejam virulentas, apenas as vivas podem causar a doença. Uma amostra de bactérias capsuladas mortas pelo calor (inofensivas), misturada com bactérias vivas sem cápsula (também inofensivas), quando injetada no animal, provocava a morte dos camundongos. Resultado totalmente inesperado, pois tanto as bactérias com cápsula mortas pelo calor, como as sem cápsula são incapazes de causar a doença. Desse modo, duas formas inofensivas da bactéria geraram uma forma nociva.  Amostras de sangue dos camundongos mortos, por essa mistura, apresentaram bactérias vivas capsuladas, ou seja, a variedade não patogênica se transformou, de modo permanente, em uma variedade patogênica. Isso foi interpretado como tendo a bactéria não patogênica se utilizado de algum ou de alguns fatore(s) presente(s) na variedade patogênica morta pelo calor, capaz(es) de transformá-la em uma linhagem capsulada patogênica.

diplococos.1

Em 1932, Alloway mostrou que um simples extrato da variedade patogênica era capaz de provocar as mesmas modificações na variedade não patogênica. A Transformação bacteriana, portanto, ocorria in vitro, em um tubo de ensaio, não havendo, necessariamente, a injeção de bactérias no camundongo. A solução do problema estava, dessa forma, em procurar, nesse extrato, o princípio transformante. Em 1944, Oswald T. Avery, Colin M. MacLeod e Maclyn McCarty, mostraram que o DNA foi, entre os compostos presentes no extrato, a única molécula capaz de promover, permanentemente, a transformação da variedade não patogênica em patogênica, fenômeno denominado transformação bacteriana, largamente empregada, nos dias atuais, na genética molecular, inclusive na tecnologia do DNA recombinante (engenharia genética). Em um dos experimentos, eles banharam o extrato com duas enzimas destruidoras de proteínas (tripsina e quimiotripsina) e perceberam que esse tratamento não eliminava a atividade transformadora. Em seguida, trataram o extrato com a RNase, enzima que decompõe o RNA e mais uma vez a transformação foi processada. Por fim, expondo o extrato à DNase, enzima que destrói o DNA, a transformação não aconteceu, confirmando que o DNA responde pelo processo. Fora encontrado, portanto, um agente específico responsável pelos fenômenos da herança. Pela primeira foi estabelecida uma relação direta entre a hereditariedade e a ação de uma determinada substância. A partir de então, o ácido desoxirribonucleico (DNA) passou a ser considerado a principal molécula informacional.

tratamento.2

Trabalhos posteriores, utilizando outras bactérias, mostraram que essa transformação ocorria, também, com outros caracteres genéticos. Foi mostrado, por exemplo, que linhagens de células se tornaram resistentes a determinados antibióticos, como a estreptomicina.

A figura a seguir mostra, resumidamente, o mecanismo molecular da transformação bacteriana descrita acima.

esq.trans.3

1. Bactéria patogênica, portando o gene S (fragmento de DNA), que codifica para uma enzima implicada na síntese da cápsula contendo os carboidratos que envolvem a bactéria patogênica (“célula S”).

2. “Cromossomo” bacteriano, representado por um DNA circular.

3. Morte, pelo calor, da bactéria patogênica, liberando o gene S.

4. Bactéria não patogênica, portando o gene R (fragmento de DNA), “associado” a não patogenicidade.

5. Penetração do gene S na célula não patogênica (“célula R”).

6. Recombinação gênica, processo que consiste na integração no “cromossomo” bacteriano, do fragmento de DNA que penetrou na bactéria receptora (“célula R”).

7. Formação da bactéria portadora do gene S (patogênica), a partir de uma célula não patogênica (“célula R”), caracterizado a transformação bacteriana. Como se pode constatar, o DNA “estranho” (“gene S”) se estabeleceu como parte do patrimônio genético da célula “hospedeira” (“célula R”), que, dessa forma, adquiriu a característica hereditária contida no segmento do DNA recebido.

O processo de transformação requer uma compatibilidade entre as bactérias doadoras e receptoras, não se verificando indiscriminadamente entre quaisquer bactérias. Embora tenha sido descoberto em condições experimentais, como mencionamos acima, a transformação pode também ocorrer na natureza, levando ao surgimento de novas linhagens bacterianas. Neste contexto, bactérias que morrem em seu ambiente natural sofrem desintegração e têm, via de regra, seu DNA partido em pedaços que podem ser captados por bactérias adjacentes. São poucas, entretanto, as bactérias dotadas da propriedade de captar DNA do meio com facilidade. O DNA que penetra na célula pode ser reconhecido e destruído pelas enzimas de restrição, que têm como função defender a bactéria contra DNAs invasores, como mostramos em “clonagem gênica”, matéria publicada neste blog no dia 26.02.2011.

II. SEGUNDA EVIDÊNCIA EXPERIMENTAL DE QUE O DNA É O MATERIAL GENÉTICO

Um segundo trabalho, realizado, em 1952, por Alfred Day Hershey e Martha Chase, no Cold Spring Harbor Laboratory em Long Island, Nova Iorque, ratificou a condição de que o DNA transporta a informação genética. Eles usaram fósforo radioativo (32P) e enxofre radioativo (35S) para mostrar que quando um bacteriófago (fago) infecta uma bactéria, é o DNA, e não a proteína da capa viral, que realmente penetra na célula hospedeira, portando as informações genéticas para a formação de novos vírus. O bacteriófago utilizado foi o T2, formado por uma molécula de DNA e um envoltório proteico, cujo “ciclo vital” já era, na época, largamente conhecido. A escolha desses elementos químicos deveu-se ao fato de o DNA não conter enxofre e as proteínas virais serem desprovidas de fósforo. Dessa forma, usando-se 32P e 35S marca-se, especificamente e respectivamente, como mencionamos acima, o DNA e as proteínas virais. A figura abaixo mostra, esquematicamente, os experimentos realizados por Hershey e Chase. Duas preparações de fagos foram marcadas com material radioativo. Uma delas com 32P nos grupos fosfatos do DNA e outra com 35S nos aminoácidos dotados de enxofre (cisteína e metionina) das proteínas das capas virais (capsídeos). As duas preparações, assim marcadas, foram adicionadas, separadamente, a suspensões de bactérias não marcadas. Cada suspensão foi agitada no homogeneizador para afastar, das bactérias, as “cabeças” virais. Em seguida, as bactérias e as capas virais foram separadas por centrifugação. Foi constatado que as células infectadas com o fago marcado com 32P continham esse elemento no seu interior, indicando que o DNA marcado havia entrado nas células e as capas virais não continham radioatividade. As células infectadas com 35S, por outro lado, não continham qualquer radioatividade no seu interior. Neste caso, o 35S foi detectado nas capas virais, que se mostraram radioativa. Algum tempo após a remoção das capas, verificou-se que ambas as preparações bacterianas produziam partículas virais, indicando que a mensagem genética para a replicação viral havia sido introduzida pelo DNA viral e não pela proteína viral.

heschey.4

Os resultados obtidos por Hershey e Chase, demonstrando que apenas o DNA viral penetra na bactéria, durante a infecção, podem ser mais bem entendidos no esquema a seguir.

fago.inf.4

A figura abaixo  é uma micrografia eletrônica do bacteriófago T2.

ewst.fago.5

Como ilustração, descrevemos a seguir, resumidamente, o “ciclo vital”do bacteriófago T2, que se assemelha à de outros fagos.

ciclo.lit.7

1. Os vírus se dispõem torno da bactéria.

2. O bacteríofago se prende à célula. Durante esta etapa de adsorção, proteínas do envoltório viral, situadas na ponta da cauda do vírus, interagem com proteínas receptoras específicas presentes na bactéria.

3. O DNA do vírus é injetado na bactéria hospedeira.

4. O envoltório proteico do vírus permanece fora da célula.

5. Novas moléculas de DNA do vírus são sintetizadas.

6. Síntese das cápsulas proteicas do vírus.

7. Formação de vírus completos (montagem), a partir das informações genéticas contidas no DNA viral que foi injetado.

8. Ruptura da bactéria (lise bacteriana) liberando centenas de novas partículas virais. Cada um desses vírus recém-liberados pode infectar uma nova bactéria, levando a que uma população inteira de bactéria seja destruída (lisada). No DNA do bacteriófago está, portanto, toda a informação genética necessária para a produção de uma partícula viral completa e infectante.

Lembramos que as bactérias têm seu próprio DNA que governa suas atividades vitais. Quando o DNA do vírus penetra na célula, interrompe a síntese de substâncias próprias da bactéria e começa a “comandar” a produção de substâncias virais, usando, nesse processo, matéria-prima da bactéria infectada. Dessa forma, os materiais presentes no interior da célula são transformados em material do vírus.

Em muitos casos, é possível infectar bactérias, ou outras células, em se tratando de outros vírus, com o ácido nucleico viral isolado, são os chamados ácidos nucleicos infecciosos. Nesse caso, todavia, a eficiência (número de células infectadas) é menor do que quando se utiliza o vírus completo.

Embora poucas dúvidas possam ser levantadas sobre a validade e a interpretação dos experimentos desenvolvidos por Hershey e Chase, vários biólogos ainda não ficaram convencidos de que o DNA era, realmente, o material genético de todos os seres vivos. Em verdade, tudo que a série de experimentos acima demonstrou foi que os genes dos bacteriófagos são feitos de DNA, não podendo, rigorosamente, ser extrapolados para outros organismos, se é que os bacteriófagos podem ser considerados organismos vivos. Um biólogo à procura de provas científicas rigorosas teria que aceitar que a natureza química do gene em outros seres ainda não tinha sido estabelecida. A partir de 1953, com a descoberta da estrutura do DNA por James D. Watson e Francis H. Crick e com a percepção de que ela era compatível com as necessidades do material genético, o DNA passou a ser universalmente aceito como material genético. Ele é o armazém, ou biblioteca celular, que contém todas as informações necessárias para a construção das células e tecidos de um organismo. A exata duplicação dessas informações, de geração para geração, garante a continuidade genética das espécies.

Conquanto tenhamos mencionado apenas dois tipos de evidências, ambas envolvendo microrganismos, para indicar que o DNA atua como material genético há uma série de outras provas que apóiam a ideia de que o ácido desoxirribonucleico é o “depósito” das instruções genéticas. A ocorrência dos ácidos nucleicos (DNA e RNA) em todos os seres vivos atuais significa que eles foram importantes na vida dos organismos primitivos. O desempenho dessas moléculas nos processos celulares e na hereditariedade indica que sua ocorrência aumentou a probabilidade de sobrevivência dos primeiros seres vivos.

 

 

 

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