Publicado por: Djalma Santos | 4 de junho de 2013

Plasmídeos

Plasmídeos ou plasmídios (figura abaixo) são pequenas moléculas circulares de DNA extracromossomiais, em dupla hélice, que podem ser passados de célula a célula. Geralmente ocorrem em bactérias e por vezes também em organismos eucarióticos, como o círculo 2µ presente na Saccharomyces cerevisiae  (ver “Plasmídeos em eucariotos”, mais adiante). Eles veiculam informações genéticas não encontradas no “cromossomo” bacteriano, presente em uma região celular denominada nucleoide, que, a exemplo dos plasmídeos, é circular e possui uma única molécula de DNA. Por esta razão, alguns autores preferem denominar esse “cromossomo”, que pode ser 1000 vezes maior que a própria célula, de corpo cromatínico, por não o considerarem um cromossomo verdadeiro. As informações veiculadas pelos plasmídios respondem, como veremos adiante, por características úteis à bactéria, como a capacidade de conjugar (plasmídeo F), resistir à antibióticos (plasmídeos R), produzir colicinas (plasmídeos col), metabolizar diferentes substratos (plasmídeos degradativos) e conferir patogenicidade à bactéria hospedeira (plasmídeos de virulência). Dessa forma, a molécula de DNA presente no nucleoide não é único depósito de genes nas bactérias.

01.nas bactérias

O tamanho do plasmídeo varia entre 1 e 250 Kpb (milhares de pares de bases) e, dependendo da espécie bacteriana, pode haver uma ou dezenas de cópias de um mesmo plasmídeo em uma única célula (figura anterior), o que aumenta muito a eficiência dos genes neles contidos. Aqueles que existem em cópia única (ou em poucas cópias) correm o risco de desaparecerem de uma das células filhas, após a divisão celular. A fim de evitar que isto ocorra, alguns plasmídeos possuem um “sistema viciante” que produz tanto um veneno de longa vida como um seu antídoto de vida curta. Dessa forma, a célula que tem uma cópia desse plasmídeo sobreviverá, enquanto a que não o possui morrerá em breve, devido a falta do antídoto. Há também plasmídeos que possuem sistemas que tentam distribuir ativamente uma cópia para cada uma das células filhas. Esse sistema é frequentemente denominado sistema de partição ou função de partição de um plasmídeo.

Embora os plasmídeos possuam genes para a própria replicação, independentemente do “cromossomo” bacteriano, eles não são essenciais para a sobrevivência da célula, em condições ambientais normais, podendo ser perdidos sem causar a morte celular. Em circunstâncias especiais, entretanto, eles podem conferir, como vimos acima, propriedades essenciais à sobrevivência da bactéria. A sua replicação independente está associada a uma sequencia de DNA que serve como “origem de replicação” ou ori (ponto de inicio da replicação do DNA) presente em todos os plasmídeos [ver CLONAGEM GÊNICA (VETOR DE CLONAGEM), matéria publicada neste blog em 26/02/2011]. A região ori (figura abaixo), que deve ser reconhecida por proteínas que participam da maquinaria de iniciação da replicação é, em última análise, uma sequência específica de cinquenta a cem pares de bases, cuja presença é obrigatória para que o plasmídeo se replique. Algumas dessas proteínas de reconhecimento são codificadas pelo “cromossomo” da célula hospedeira. Dessa forma, a presença de um plasmídeo no interior de certo hospedeiro depende desse reconhecimento. Alguns plasmídeos, como o pBR322 e o ColE1, têm uma faixa restrita de hospedeiro onde podem se duplicar. Outros, como o RK2, em função de serem capazes de codificar as proteínas que necessitam para iniciar a replicação, podem se duplicar numa ampla faixa de hospedeiros. Plasmídeos que se multiplicam em muitas espécies são denominados promíscuos.

02.promiscuo

Os plasmídeos podem ser transferidos naturalmente de uma cepa bacteriana para outra, permitindo que a célula receptora adquira um conjunto de informações genéticas que não recebera ao “nascer”. Podem, ainda, ser transmitidos, juntamente como o restante do genoma bacteriano, durante a divisão celular, conservando uma ou mais cópias em cada célula-filha (figura a seguir)

03.celula.filha

Devido a sua habilidade de replicação independente e a sua capacidade de recombinação, os plasmídeos são muito utilizados na clonagem gênica (técnica do DNA recombinante ou engenharia genética), para transferir genes entre organismos diferentes e, juntamente com os genes virais e os transposons (genes “saltitantes”), podem ser considerados elementos dotados de mobilidade (veja detalhes mais adiante em “Vamos aprender um pouco mais sobre os transposons”). Quando utilizados como vetores de clonagem, os plasmídeos devem transportar um ou mais genes (“marcas’) que lhe confiram propriedades particulares, como a resistência a certos antibióticos. Essas marcas que atuam na seleção das bactérias transformadas são, em última análise, indicadores selecionáveis. O esquema a abaixo mostra um plasmídeo com dois genes relacionados com a síntese de antibióticos e a região ori (origem de replicação), mencionada acima. A adição do antibiótico ao meio de cultura eliminará as células que não tenha adquirido o plasmídeo, possibilitando uma identificação direta das bactérias modificadas, capazes de sobreviver nesse meio de cultura [ver CLONAGEM GÊNICA (VETOR DE CLONAGEM), matéria publicada neste blog em 26/02/2011]. Dessa forma, o antibiótico atua como um filtro para selecionar apenas as bactérias modificadas. A partir do cultivo e da lise dessas bactérias, pode-se isolar o referido plasmídeo.

04.plasmideo

O pBR322 (figura a seguir), primeiro plasmídeo artificial, tem sido um dos mais utilizados vetores de clonagem em E.coli. Ele foi construído em 1977 e seu nome deriva de p (plasmídeo) e BR, Bolivar e Rodrigues, pesquisadores mexicanos, que o construiu. Ele possui 4361 pares de bases e, além da origem de replicação (ori), que permite a sua propagação em bactérias, apresenta o gene ampR, que codifica a proteína de resistência a ampicilina e o gene tetR, que codifica a proteína de resistência à tetraciclina. Dessa forma, a introdução desse plasmídeo em E. coli, que normalmente é sensível tanto à ampicilina como à tetraciclina, leva ao aparecimento de bactérias capazes de crescer em meio (líquido ou sólido) contendo esses antibióticos.

05.antibioticos

 VAMOS APRENDER UM POUCO MAIS SOBRE OS TRANSPOSONS

Os transposons (genes “saltitantes” ou elementos de transposição) são sequências específicas de DNA dotadas da capacidade de se mover de uma posição para outra no mesmo cromossomo ou de um cromossomo para outro, independentemente da homologia entre a região onde se encontram inseridos e o local ao qual se destinam. Dessa forma, a localização desses genes “saltitantes” no genoma e instável. Esse fenômeno, denominado transposição e catalisado por uma enzima chamada transponase, foi descoberto, em milho, nos anos de 1950, por Barbara McClintock, o que lhe valeu o Prêmio Nobel de Medicina em 1983. Sua presença foi confirmada mais tarde em bactérias e sabe-se hoje que estão presentes em todos os organismos, inclusive nos seres humanos, cujo genoma possui aproximadamente 15% de elementos transponíveis. O caráter dinâmico dos transposons tem uma grande influência na evolução e na composição de genomas de animais e vegetais. Em se tratando de bactérias, eles podem saltar de um local para outro no “cromossomo” bacteriano ou do “cromossomo” para um plasmídeo. Podem igualmente pular de uma região para outra do mesmo plasmídeo, de um plasmídeo para outro ou de um plasmídeo para o “cromossomo” bacteriano. Em face de eles poderem saltar de um plasmídeo para outro, podem ser transferidos, através da conjugação, de uma bactéria para outra, exacerbando o processo de resistência. Neste contexto, um único plasmídeo R, por exemplo, pode ter diferentes transposons com genes de resistência, como o Tn3 (resistência à ampicilina), o Tn4 (resistência à estreptomicina, à sulfonamida e ao mercúrio, além de conter o Tn3), o Tn5 (resistência à caramicina) e o Tn10 (resistência à tetraciclina). A inserção do transposon em um novo sítio do genoma, principalmente se ocorre em um gene codificador de proteína, bem como sua saída do local onde se encontrava inserido, pode impedir a atividade gênica, provocando mutações. O esquema abaixo mostra uma mutação provocada por um elemento de transposição. É evidente que nem todos os transposons provocam efeitos deletérios. Eles podem dirigir a evolução dos genomas, facilitando, inclusive, a translocação de sequência genômica.

06.genomica

Um plasmídeo dotado da capacidade de existir livre no citoplasma ou integrado ao “cromossomo” bacteriano (figura a seguir), como fator o F (de fertilidade), presente nas bactérias doadoras (ou “macho”), recebe o nome de epissomo ou plasmídeo integrado. Nas cepas doadoras F+ esse fator se encontra livre no citoplasma e nas linhagens doadoras Hfr (“high frequency of recombination”), também conhecida com Afr (alta frequência de recombinação), ele se encontra integrado ao “cromossomo”. O plasmídeo F pode ser mantido de modo estável, compondo a constituição genética da bactéria, durante várias divisões celulares, mas sempre em algum estágio existe como elemento independente.

07.independente

Com o uso de técnicas de engenharia genética é possível isolar os plasmídeos, inserir neles fragmentos específicos de DNA (genes) e, em seguida, transplantá-los para outras bactérias, promovendo, dessa forma, a transferência de características genéticas de uma célula para outra. Eles são, portanto, ideais para transportar genes para o interior das bactérias, tendo sido, inclusive, os primeiros vetores utilizados na clonagem de genes. A elevada capacidade de duplicação dos plasmídeos em relação ao “cromossomo” bacteriano permite que sejam formadas múltiplas cópias de plasmídeo, com fragmentos inseridos, dentro da bactéria.

EPISSOMO NÃO BACTERIANO

Outro exemplo de epissomo é o material genético dos fagos temperados, como o fago lambda da E. coli, que pode se encontrar livre no citoplasma (estado vegetativo), ou integrado ao “cromossomo” bacteriano (estado reprimido), constituindo as bactérias lisogênicas (geradoras de lise ou ruptura). No estado reprimido, o material genético do bacteriófago é copiado a cada divisão celular junto como o DNA da bactéria hospedeira. Por indução, que pode ser provocada por radiações ultravioletas (UV), como mostra a figura a seguir, o DNA fágico reprimido, denominado profago ou provírus, pode ser liberado no citoplasma e promover a lise bacteriana. O ciclo viral que se processa com o fago no estado vegetativo (reprimido) é denominado ciclo lisogênico, enquanto aquele em que ocorre a lise bacteriana (estado vegetativo) constitui o ciclo lítico.

08.ciclolitico

Lembramos que os fagos virulentos, ao contrário dos temperados, não promovem ciclo lisogênico, mas apenas ciclo lítico. O esquema abaixo mostra a sequência de eventos que ocorre durante o ciclo reprodutivo do T2 (fago virulento). Durante esse processo, o vírus adere à bactéria, graças a uma proteína receptora bacteriana; injeta seu DNA na célula; multiplica seu material genético; sintetiza proteínas da cápsula, que não penetrou durante a infecção e lisa a bactéria, liberando novas partículas virais, que infectarão outras bactérias.

09.outrasbacteria

Descreveremos a seguir as cinco principais categorias de plasmídeos, tendo por base os genes que transportam e as características funcionais que esses genes conferem à bactéria. Alguns plasmídeos podem pertencer a mais de um desses grupos funcionais e em uma única célula podem coexistir vários tipos diferentes de plasmídeos, como na Escherichia coli, que contém até sete. Alguns plasmídeos são incompatíveis, fenômeno denominado incompatibilidade plasmidial, e a interação entre dois destes plasmídeos pode levar a destruição de um deles. Dessa forma, os plasmídeos também podem ser colocados em “grupos de incompatibilidade” (ou grupo Inc), que dependem da sua capacidade de coexistirem numa única célula.

I. Plasmídeo F (fator de fertilidade bacteriana ou fator sexual bacteriano): relacionado com a sexualidade das bactérias, sendo capaz de dirigir a conjugação entre cepas diferentes, como no caso da plasmídeo F da Escherichia coli. Presente nas bactérias doadoras (ou “machos”) e ausente nas receptoras (ou “fêmeas”), ele contém genes que codificam a fímbria sexual ou pilus F (pili de conjugação), necessária para que a bactéria possa transferir material genético durante a conjugação. Neste processo, ocorre passagem unidirecional de genes da cepa doadora para a receptora, através de comunicações (pontes de conjugação) que se formam entre os citoplasmas das duas células, conectando as duas bactérias (figura abaixo). Posteriormente, as bactérias que trocaram material genético se reproduzem por bipartição (divisão binária ou cissiparidade) passando a herança às descendentes. Devido à presença do fator F, as fímbrias sexuais, de natureza proteica, compostas por subunidades repetitivas de uma proteína denominada genericamente de pilina, estão presentes apenas nas cepas “machos”. As “fêmeas”, por outro lado, possuem na sua superfície macromoléculas que facilitam a fixação das referidas fímbrias.

10.fimbrias

Na cissiparidade (figura a seguir), forma assexuada de reprodução, a bactéria duplica seu DNA, por círculo rolante, cresce e se divide, dando origem a duas células filhas geneticamente idênticas (clones). Lembramos que a divisão celular nas bactérias (seres procariontes) ocorre por amitose (divisão direta) e não por mitose (divisão indireta). Na mitose, ao contrário da amitose, ocorrem uma divisão nuclear (cariocinese) e uma divisão citoplasmática (citocinese ou citodiérese).

11.citodierese

II. Plamídeos de resistência (R): também denominados fatores de transferência de resistência ou fatores R, são plasmídeos dotados de genes que codificam enzimas capazes de degradar agentes antibacterianos, como o cloaranfenicol e a ampicilina, tornando as bactérias resistentes à ação desses agentes terapêuticos. Essa propriedade genética do plasmídeo R permite que as bactérias sobrevivam mesmo na presença desses agentes. Como cada célula bacteriana contém, via de regra, várias cópias do mesmo plasmídeo, os agentes antibacterianos são, muitas vezes, destruídos com grande eficiência. A seleção natural imposta por esses agentes favorece, portanto, as células bacterianas que incorporaram esse fator de resistência. A existência de plasmídeos com diversos genes de resistência a diferentes antibióticos é um problema sério no tratamento de doenças causadas por bactérias. Em virtude da utilização generalizada de antibióticos, os plasmídeos evoluíram a ponto de conferir multirresistência aos seus hospedeiros bacterianos, dificultando o tratamento dessas doenças. Além disto, muitos plasmídeos são dotados, também, de “genes de transferências”, que codificam proteínas capazes de formar fímbria sexual, através das quais as bactérias transferem plasmídeos entre si, contribuindo para a proliferação de estirpes  multirresistentes. Em face da sua dispersão, nas populações naturais, ter graves consequências no tratamento de infecções bacterianas, esses plasmideos são muito importantes na microbiologia clínica.

III. Plamídeos col: transportam genes que codificam as colicinas (bacteriocinas), que inibem ou matam espécies intimamente relacionadas ou mesmo diferentes linhagens de uma mesma espécie, que não albergam o referido plasmídeo, com o intuito de obter uma maior vantagem adaptativa em relação às outras cepas. As colicinas são substâncias proteicas solúveis produzidas por Escherichia coli e outros membros da família Enterobacteriaceae e já são conhecidas mais de 30 tipos diferentes. Estudos mostram que elas são produzidas sob condições de estresse, como a ausência de nutrientes; que apenas uma fração das bactérias colicinogênicas é induzida a produzir colicina e que estas bactérias são protegidas contra as colicinas que produzem, por proteínas de imunidade expressas constitutivamente.

IV. Plamídeos degradativos (plasmídeos metabólicos): permitem que a bactéria hospedeira digira substâncias incomuns (pouco habituais), como tolueno e ácido salicílico. Vários exemplos ocorrem no gênero Pseudomonas, como o TOL de Pseudomonas putida. A P. putida, oficialmente descoberta em meados de 1900 e encontrada em vários ambientes, é uma bactéria gram-negativa, não patogênica. Graças ao seu metabolismo muito diverso, incluindo a capacidade de degradar solventes orgânicos como tolueno, ela exerce papel importante no controle da poluição, atuando na biorremedição (utilização de seres vivos na recuperação de áreas contaminadas).

V. Plasmídeos de virulência: conferem patogenicidade à bactéria hospedeira, transformando-a, portanto, em um agente patogênico. O exemplo mais bem conhecido é o plasmídeo Ti (do inglês Tumor iniciation) da Agrobacterium tumefaciens, que carrega genes para a indução de tumor em plantas. Invadindo a planta no sítio de uma ferida, esse plasmídeo transforma as células próximas e induz a formação de um tumor, chamado de coroa de galha (do inglês crown gall), doença que afeta a maioria das plantas dicotiledôneas e caracteriza-se pelo crescimento de tumores na junção entre o caule e a raiz (coroa) ou diretamente nas raízes da planta infectada. Embora essa doença seja conhecida desde a antiguidade, o seu agente etiológico (A. tumefaciens) só foi descrito em 1907. Os conhecimentos produzidos, a partir desta data, levaram a uma compreensão bastante profunda acerca desse parasitismo, ao ponto de ele ser considerado, modernamente, um sistema modelo para estudos das relações patógeno-hospedeiro nos vegetais. O plasmídeo Ti contém cerca de 200 quilobases, existe em cópia única, com genes que codificam para várias funções, quase todas relacionadas com sua transferência e sua integração no genoma da célula vegetal. A figura abaixo mostra, esquematicamente, o mapa genômico, resumido, desse plasmídeo, destacando os mais importantes grupamentos gênicos. O tamanho e a posição relativa desses grupamentos variam de acordo com a linhagem do Agrobacterium. O conhecimento das bases moleculares envolvidas no processo de infecção de uma planta hospedeira pela Agrobacterium sp., permitiu a utilização desta bactéria como vetor natural de transformação genética de plantas.

12.de plantas

1. Região T-DNA (DNA de transferência): corresponde ao segmento de DNA que é transferido e integrado no genoma da célula vegetal, daí a denominação T-DNA (“transferred DNA”).  Os genes presentes nessa região codificam enzimas relacionadas com a biossíntese de reguladores de crescimento, auxinas e citocininas. Essa síntese causa uma alteração hormonal, levando, via de regra, à formação do tumor no local da infecção.

2. Regiões Tra (regiões de transferência conjugativa): regiões dotadas de genes cuja expressão origina produtos que governam a transferência, através da conjugação, desse plasmídeo para outras espécies compatíveis de Agrobacterium.

3. Região Occ (região Opc): nesta região estão os genes que codificam para síntese e catabolismo de opinas, compostos formados pela condensação de carboidrato e aminoácidos, que funcionam como uma fonte de alimentos para a bactéria. Nas células tumorais, as opinas são produzidas em altas concentrações e secretadas para o meio circundante, onde apenas a Agrobacterium pode metabolizá-la. Desse modo, esta bactéria desvia os recursos das plantas, convertendo-os em uma forma que apenas ela é beneficiada. O patógeno, em verdade, transforma a planta de uma maneira “inteligente”. Ele cria para si uma vantagem seletiva ou nicho ecológico exclusivo, pois apenas ele á capaz de utilizar, como fonte de carbono e nitrogênio, a opina, cuja síntese ele codifica e que após, a inserção do T-DNA, passa também a ser produzida pela planta e colocada a sua disposição. Portanto, ao introduzir seu material genético na planta, a bactéria prepara uma espécie de “colonização genética”, criando um habitat único e específico no qual apenas ela está geneticamente equipada para utilizar a opina.

4. Região Rep (região de replicação): contém genes relacionados com a origem de replicação e funções associadas à manutenção do plasmídeo dentro da bactéria, bem como com o controle do número de cópias e a incompatibilidade entre bactérias.

5. Região Vir  ou Genes Vir  (Vir = virulência): esta região contém uma série de genes (VirAVirBVirCVirDVirEVirF eVirG) envolvidos na síntese de proteínas responsáveis pelo processo de transferência da região T-DNA.

As regiões descritas cobrem cerca de dois terços do plasmídeo Ti. Dessa forma, mais genes já foram identificados, alguns relacionados com a determinação do espectro de hospedeiro. Há também genes que codificam proteínas que vão regular a expressão de outros genes presentes no plasmídeo. É evidente que há ainda funções desconhecidas nesse plasmídeo, que, provavelmente, não estão diretamente envolvidas no desenvolvimento do tumor.

Os plasmídeos podem ser classificados ainda em conjuntivos e não conjuntivos. Os conjuntivos contêm um gene denominado tra-gene que responde pelo início da conjugação bacteriana. Os não conjuntivos são desprovidos desse gene, embora possam ser transferidos durante a conjugação.

Os plasmídeos são ferramentas fundamentais nos laboratórios de genética e bioquímica, onde são usados rotineiramente para multiplicar genes específicos. Muitos deles estão disponíveis no mercado, para construção de bibliotecas genômicas ou clonagem direta de genes, como o clássico pBR322, largamente empregado na construção dessas bibliotecas e que deu origem a um grande família de plasmídeos modernos. Biblioteca genômica, também denominada biblioteca de genes ou banco genômico (figura a seguir), é uma coleção de um grande número de fragmentos de DNA do genoma, bacteriano ou fágico (clones), armazenados em vetores para posterior utilização.

13.utilização

Outro uso importante dos plasmídeos é na produção de grandes quantidades de proteínas úteis aos seres vivos, inclusive ao homem. Entre elas podemos citar: insulina, hormônio do crescimento, gonadotrofina humana, interferons, fatores de coagulação do sangue, antitrombina, albumina sérica humana e fator de necrose tumoral [ver CLONAGEM GÊNICA (APLICAÇÕES DA ENGENHARIA GENÉTICA), matéria publicada neste blog em 26/02/2011].

PLASMÍDEOS EM EUCARIOTOS

Os plasmídeos não estão limitados às bactérias. Eles já foram detectados em leveduras e em fungos filamentosos. Na levedura Saccharomyces cerevisiae, por exemplo, ocorre um plasmídeo de DNA circular dupla fita, a semelhança dos plasmídeos bacterianos, com 6.318pb, denominado círculo 2µ e dotado de uma única origem de replicação (ARS, do inglês autonomous replication sequence). Cada célula haploide pode conter 60 a 100 cópias desse plasmídeo. Ele codifica um sistema de partição que promove a dispersão aleatória, entre mãe e filha, das múltiplas cópias, quer durante a mitose ou meiose. O referido plasmídeo ainda alberga genes que catalisam as recombinações sítio-específicas e a regulação da expressão gênica. Os plasmídeos círculo 2µ se localizam no núcleo e são empacotados como cromatina.

Do exposto, podemos deduzir que a finalidade dos plasmídeos, na natureza, é, em última análise, transferir genes de uma célula para outra. Em função de, na grande maioria dos casos, o número de plasmídeo ser mais elevado que o número de cromossomos é mais importante para as células terem esses genes na partícula plasmidial.

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Responses

  1. muito bom

    • Prezada Denilson
      Agradeço o comentário. Disponha do nosso blog. Ele existe para auxiliar os interessados em biologia.
      Um forte abraço
      Djalma Santos

  2. Muito bom mesmo, me ajudou na prova de microbiologia!! Completíssimo! Parabéns professor.

    • Prezada Monique
      Obrigado pelo comentário.Disponha do nosso blog.
      Sucesso
      Djalma Santos


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