Publicado por: Djalma Santos | 10 de junho de 2011

Ribozima (“RNA super star”)

Principais publicações iniciais

 CATÁLISE NOS SISTEMAS BIOLÓGICOS

As células vivas são as sedes das reações químicas, indispensáveis a sua atividade. Essas reações se desenvolvem graças à presença de catalisadores que aceleram esses processos de modo considerável. A importância dos catalisadores nos sistemas vivos se deve, em linhas gerais, ao fato de as moléculas biológicas serem geralmente “estáveis” e sem intervenção externa elas reagem muito lentamente. Os catalisadores biológicos, chamados enzimas, aceleram essas reações tornando sua cinética compatível com a do funcionamento global dos organismos vivos. Todas as moléculas biológicas dotadas de atividade catalítica, descritas até o início dos anos 80, eram proteínas que, funcionando como moléculas operacionais, catalisam as diversas reações químicas, constituintes do metabolismo celular.

Durante os anos 30 e 40 estudou-se bastante os aspectos catalíticos da bioquímica celular, mas pouco se conhecia acerca dos mecanismos celulares relacionados à informação genética. 1944 foi um ano decisivo neste campo, ocasião em que Oswald Avery e colaboradores do Instituto Rockefeller descobriram que o DNA (ácido desoxirribonucleico) era o suporte das informações genéticas. Pesquisas realizadas, em 1952, por Alfred Hershey e Martha Chase ratificaram os trabalhos desenvolvidos por Avery e colaboradores. Hershey e Chase utilizaram fósforo radioativo (32P) e enxofre radioativo (35S) para mostrar que quando um bacteriófago (fago) infecta uma bactéria, é o DNA, e não a proteína da capa viral, que realmente penetra na célula hospedeira, portando as informações genéticas para a formação de novos vírus. A etapa seguinte nessa escalada foi efetuada em 1953 por James Watson e Francis Crick, quando da descoberta da estrutura do DNA (figura abaixo). Esses estudos pioneiros, associados a vários outros que se seguiram, forneceram elementos indicativos de que a informação genética é codificada pela sequência de nucleotídeos presentes na dupla hélice do DNA. Cada uma das duas cadeias dessa molécula é um polímero constituído de nucleotídeos monofosfato, que são: adenosina (A), guanosina (G) timidina (T) e citidina (C).

01.DNA

Uma segunda classe de ácido nucleico, o RNA (ácido ribonucleico), também associado às informações genéticas, é um polímero de uma só cadeia e muito semelhante ao DNA, que possui o nucleotídeo uridina (U) no lugar do nucleotídio timidina (T). Os vários tipos de RNA constituem uma classe altamente complexa de moléculas com uma vasta variedade de papéis ao nível celular. Estudos realizados a partir dos anos 50, puseram em evidência várias funções importantes dos RNAs na transferência da informação genética do DNA às proteínas. Indicaram, por exemplo, que a primeira etapa da expressão de um gene é a transcrição do DNA (figura a seguir). Isso significa dizer que a partir da sequência em nucleotídeos deste ácido nucleico, a célula produz o RNA mensageiro (RNAm), que funciona como base para o encadeamento dos aminoácidos, por ocasião da síntese proteica. A transmissão intracelular da mensagem genética é apenas um dos papéis dos RNAs em geral. O próprio ribossomo, sede da síntese proteica, contém várias moléculas de RNA, os chamados RNA ribossomais (RNAr).

02.rnar

Um terceiro grupo de ácidos ribonucleicos, os RNA transportadores (RNAt), são também conhecidos (figura abaixo). Trata-se de pequenas moléculas que participam da fixação dos aminoácidos na cadeia proteica, quando essas são elaboradas tendo por base as informações contidas nos RNAm.

03.rnam

Nos fins dos anos 70, começava-se a compreender relativamente bem as funções desses três RNAs (RNAm, RNAr e RNAt) e pensava-se que essas moléculas não apresentavam muita coisa a esconder. Os ácidos nucleicos (DNA ou ácido desoxirribonucleico e RNA ou ácido ribonucleico) estavam, “sem dúvida”, associados à estocagem e à transmissão das mensagens genéticas, contendo, nas suas sequências, as informações necessárias ao metabolismo e à reprodução. O dogma central da biologia molecular, proposto em 1958 por Francis Crick, retrata esse pensamento. Esse dogma postula, em última análise, que a transmissão da informação genética ocorre no sentido DNA-RNA-Proteína (figura a seguir). Muitos estudos, entretanto, têm mostrado que o papel do RNA não se resume apenas a essa atividade intermediária, e que diversas moléculas de RNA exercerem função de primeira linha em vias fundamentais de regulação gênica.

04.gem

Lembramos que com a descoberta, na década de 1970, por Howard Martin Temin e David Baltimore, independentemente, que os retrovíruos têm a capacidade de transferir a informação genética do RNA para o DNA, foi estabelecido a inversão do dogma central (figura abaixo). Nesse caso, a síntese do DNA a partir do RNA é feita pela transcriptase reversa, que é uma DNA polimerase dependente de RNA. A transcriptase reversa foi isolada de vírus do sarcoma de Rous e da leucemia das aves. Esses vírus produzem câncer em animais e possuem um RNA de fita única como seu material genético.O DNA sintetizado nessa reação é integrado ao genoma da célula e será replicado, juntamente como DNA celular, toda vez que se divide. Apesar disto, o dogma central, proposto por Francis Crick, permanece, ainda hoje, como um dos conceitos básicos da genética molecular.

05.MOL

A divisão de trabalho entre macromoléculas no seio celular, em que todos os atos catalíticos eram exercidos por proteínas (as enzimas) e que os RNAs estavam estreitamente ligados à expressão das informações genéticas, parecia clara e constituía um dogma aparentemente bem estabelecido na bioquímica. A descoberta, na década de 1980, pelo grupo de Thomas Cech, a partir de trabalhos com os íntrons do grupo I e pelo grupo de Sidney Altman a partir de trabalhos com a Ribonuclease P (RNase P), mostrando que certos RNAs podiam ser também catalisadores, veio de encontro a essa visão clássica, não sendo mais correto supor que todas as ações catalíticas dentro da célula sejam assumidas por proteínas. Longe de ser uma simples curiosidade, as enzimas RNA, chamadas ribozimas, são alvo de importante interesse científico, não só pela especulação sobre a origem da vida, permitindo imaginar os primeiros momentos da evolução dos seres vivos, mas também em nível de pesquisa em biologia molecular e, acima de tudo, em razão de suas potenciais aplicações terapêuticas. No que diz respeito à pesquisa fundamental, as ribozimas podem ser utilizadas como ribonucleases de restrição específica, ferramentas importantes para analisar as estruturas secundárias e para interferir nas atividades dos RNAs, seja in vitro ou in vivo. No que concerne à aplicação terapêutica, as ribozimas podem, em princípio, serem utilizadas para inativar certos genes, degradar RNAs específicos ou lutar contra os vírus, tais como o HIV (vírus da imunodeficiência humana), agente etiológico da AIDS (síndrome da imunodeficiência adquirida), desde que elas podem ser usadas para inibir especificamente uma etapa chave do ciclo viral. Neste contexto, diversas empresas farmacêuticas vêm investindo no desenvolvimento de ribozimas artificiais para o controle de vírus humanos. A descoberta das ribozimas veio, também, esclarecer certas funções celulares importantes, como no caso dos ribossomos que são constituídos por moléculas de RNA e de proteínas. Pensava-se que estas últimas catalisavam a síntese proteica, uma das atividades biológicas mais importantes. Esse papel, entretanto, é desempenhado por RNAs ribossômicos, que atuando como ribozimas, catalisam as ligações peptídicas, unindo aminoácidos. “O ribossomo é uma ribozima” como resumiu brilhantemente Thomas Cech.

GENES EM MOSAICO E SPLICING (PROCESSAMENTO)

No fim dos anos 70, os biologistas descobriram, nos organismos eucarióticos, os chamados genes em mosaico (figura abaixo). Isso significa dizer que a sequência, em nucleotídeos do DNA, capaz de codificar uma cadeia proteica, não é contínua como se pensava anteriormente. Ao contrário, as sequências codificadoras, chamadas éxons, são separadas por segmentos não codificadores, chamados íntrons ou sequências intervenientes (IVS). Os genes desses organismos, portanto, são copiados em uma molécula de RNA maior que o “necessário”. Após a transcrição, os íntrons são excisados, quer dizer eliminadas da cadeia do RNA, e os exons são reunidos, graças a um processo chamado splicing (processamento), em uma molécula contínua.

06.CONT

O splicing de um RNA é um mecanismo complexo que compreende, em linhas gerais, o reconhecimento das fronteiras entre os íntrons e os éxons, o corte preciso do RNA ao nível desses pontos de junção, a excisão dos íntrons e a ligação ordenada dos éxons entre si para produzir uma molécula de RNA funcional (figura a seguir). Esse processo de maturação não é um apanágio dos RNAs mensageiros. Outros RNAs maturos derivam de precursores dotados de íntrons. É o caso, por exemplo, dos RNAs ribossomais.

07.ROB

DESCOBERTA DAS RIBOZIMAS

As ribozimas (palavra formada a partir de ácido ribonucleico e enzima), são RNAs dotados de atividade catalítica, principalmente de atividade RNasica, que pode ser exercida en cis, sobre eles mesmos ou en trans, sobre outras moléculas. Elas são, teoricamente, capazes de clivar um grande número de moléculas de RNA. As ribozimas representam um tipo particular e natural de moléculas antissenso com todas os atributos dos RNAs antissenso mais a vantagem da função catalítica. Estes RNAs são produzidos a partir do filamento complementar presente no lado oposto da fita codificadora que produz o RNA senso (figura abaixo). As ribozimas já foram utilizadas como RNase de restrição in vitro e como agente de controle específico da expressão genética in vivo e podem ser consideradas como ribonucleases de restrição programáveis.

08.PROG

Foi a partir do estudo de splicing de um RNA que teve início, por volta de 1980, a história das ribozimas. Naquela época, na Universidade do Colorado, Thomas Cech e colaboradores estavam estudando os genes do RNA ribossomal (RNAr) da Tetrahymena thermophila, um protozoário ciliado. A fim de compreender como se exprimiam esses genes, era preciso estudar o splicing e outras etapas que ocorrem durante a maturação que leva à produção do RNAr final. Esse protozoário, como outros eucariotos, possui quatro RNAr diferentes, três dos quais transcritos, a partir do DNA, em uma única molécula de RNA. Esse transcrito primário é em seguida processado e modificado, para produzir os RNAs “maduros”. Uma das primeiras etapas da maturação se efetua nos primeiros segundos que se seguem à transcrição e se trata da excisão de um íntron de aproximadamente 400 nucleotídeos, a partir de um transcrito primário de 6400 nucleotídeos. A excisão do íntron é concomitantemente com a ligação dos éxons adjacentes. Thomas Cech e colaboradores constataram, para grande surpresa, que os íntrons desse RNA podiam ser excisados eficazmente in vitro, em total ausência de proteínas. Eles começaram tentando estabelecer as condições mínimas necessárias capazes de efetuar o splicing in vitro, incubando o pré-RNA ribossômico (não processado) com extratos provenientes do núcleo da Tetrahymena, que eles supunham conter as enzimas necessárias a esse processo. Thomas Cech e colaboradores perceberam que o splicing ocorria em quase todas as frações testadas, inclusive na fração controle, na qual não fora utilizada o extrato nuclear, logo em ausência de proteínas. Era preciso, entretanto, eliminar a possibilidade da existência de uma proteína contaminante ou fortemente ligada ao RNA. A confirmação de que o splicing dos pré-RNA ribossômicos da Tetrahymena é uma atividade intrínseca da estrutura do RNA e que as proteínas são “inúteis” para esse mecanismo veio da observação do splicing “espontâneo” de um RNAr sintético, produzido por transcrição in vitro, do gene correspondente clonado. O RNA produzido jamais tivera tido contato com célula, logo não podia ter sido contaminado com enzimas proteicas capazes de excisar íntrons e ligar éxons. Apesar disso, ele se mostrou capaz de excisar e de processar seu próprio íntron nos mesmos locais que in vivo, em ausência total de proteína. Só a presença de magnésio e de um nucleotídeo que entra na composição do RNA, a guanosina, eram necessários. Constatou-se que a guanosina não era utilizada como fonte de energia, mas sim como um monômero a ser anexado ao íntron excisado (figura a seguir). Uma reação bioquímica, o corte da cadeia, seguido pela ligação, ocorria, portanto, sem a presença de enzima proteica. Com os íntrons do grupo I foram descobertos os primeiros RNAs catalíticos. Pela primeira vez era observado que uma macromolécula biológica, não proteica, apresentava uma atividade catalítica.

09.CATAL

Foi constatado rapidamente que o autoexcisão se assemelhava, realmente, a uma catálise enzimática. Dentre outras propriedades, as reações apresentavam uma grande especificidade e quando o RNA era colocado em uma solução que o impedia de se dobrar, ele perdia sua capacidade de se excisar. Esta última observação é uma indicação que a estrutura tridimensional do RNA exerce um papel essencial na excisão, do mesmo modo que a estrutura terciária das cadeias dos aminoácidos intervém, de forma fundamental, na atividade enzimática das proteínas. Após os trabalhos pioneiros do grupo de Cech, uma série de outros íntrons, capazes de autoprocessamento, foram identificados em diferentes organismos. Eles têm sido descritos em outros protozoários, bactérias, fungos e organismos superiores como o milho e o feijão. Essa atividade tem sido descrita, também, em outros organoides celulares, tais como mitocôndrias e cloroplastos, não sendo, portanto, restrita aos ribossomos.

Os íntrons são classificados em dois grupos (grupo I e grupo II), com base nas suas semelhanças estruturais e no seu mecanismo de splicing. O íntron da Tetrahymena, o mais estudado e o melhor caracterizado, foi transformado em protótipo dos íntrons do grupo I (figura anterior). Os íntrons do grupo II, encontrados, geralmente, em cloroplastos de plantas e Euglena e em mitocôndrias de plantas e fungos, parecem ser menos numerosos e são menos conhecidos que os do grupo I. Ao contrário destes, a autoexcisão dos íntrons do grupo II (figura abaixo) ocorre sem guanosina e durante o processo se forma uma estrutura intermediária em forma de laço, que não é observada no caso dos íntrons da Tetrahymena ou de outros homólogos do grupo I.

10.GRUPOI

Uma molécula de RNA é um longo polímero constituído de quatro nucleotídeos que são: citidina (C), uridina (U), adenosina (A) e guanosina (G). Esses quatro nucleotídeos se sucedem, segundo arranjos variados, ao longo da molécula, gerando uma sequência característica. Eles têm, dentre outras, a propriedade de se associar dois a dois por intermédio de ligações energéticas fracas do tipo pontes de hidrogênio. Esses pareamentos ocorrem entre A e U e C e G. Dessa forma, uma molécula de RNA pode se ligar a um outro RNA ou se dobrar sobre ela mesma se, neste caso, existirem sequências complementares de um lado e do outro, de modo a que os citados pareamentos sejam possíveis. Com o objetivo de conhecer precisamente as porções da molécula associadas à catálise, as sequências de nucleotídeos de diferentes íntrons do grupo I foram comparadas. Utilizando essa metodologia, F. Michel e colaboradores, do Centro de Genética Molecular de Gif-sur-Yvette na França mostraram, em 1982, que todos os íntrons do grupo I têm uma estrutura comum. Com base nesses dados foi possível determinar a posição do centro catalítico, que foi posteriormente confirmado utilizando mutações dirigidas, que consistem em modificar certos nucleotídeos dentro da cadeia. Uma outra sequência do íntron permite o reconhecimento preciso do sítio de corte ao nível da junção íntron-exon. A exemplo das reações enzimáticas clássicas, a reação de splicing é reversível, podendo os íntrons excisados reintegrar RNAs em sítios específicos. Essa reversibilidade é responsável, certamente, pela difusão dos íntrons entre os genes. É preciso mencionar que nem todos os íntrons do grupo I são capazes de autoprocessamento. Em relação a alguns, a reação é necessariamente catalisada por proteínas. Mesmo no caso de auto-catalise, sabe-se que as proteínas, de certa forma, facilitam realmente a reação, pois essa é cerca de 50 vezes mais rápida in vivo que in vitro.

Os íntrons, como descritos aqui, não se constituem verdadeiras enzimas, visto que a reação de splicing é um rearranjo intramolecular, quer dizer ela envolve um único RNA, que age sobre ele mesmo, ao contrário das enzimas clássicas que catalisam a reação de reagentes estranhos. Há ainda a considerar que nas condições mencionadas, eles não podem agir sucessivamente sobre vários RNAs. Na época da descoberta dos RNAs catalíticos, surgiu a transcrição in vitro, uma metodologia que permite a síntese de novas moléculas de RNA. Essa técnica permitiu dissecar e testar a atividade de RNAs catalíticos modificados. O resultado mais importante nesse domínio foi a obtenção de íntrons que se comportavam como verdadeiras enzimas, capazes de agir sobre outras moléculas de RNA sem ser eles mesmos modificados e serem recuperados após o processo. Isso fez nascer realmente o conceito de ribozima. Alguns anos mais tarde, Jennifer Doudna e colaboradores, do hospital geral de Massachusetts, mostraram que um íntron da Tetrahymena modificado pode se comportar como uma RNA polimerase, uma enzima proteica capaz de alongar uma molécula de RNA.

Cabe neste momento uma questão: verdadeiras enzimas RNA encontram-se nas células ou elas são apenas frutos de manipulações genéticas no laboratório? A resposta a essa questão surgiu a partir de estudos de uma enzima, a ribonuclease P (RNase  P), que se encontra nas células de procariotos e de eucariotos e é responsável pela maturação do RNA transportador (RNAt). Sabe-se que os precursores do RNAt (pré RNAt) apresentam uma sequência variável na sua extremidade 5′, que deve ser cortada para dar lugar a uma molécula funcional, capaz de assumir seu papel na síntese proteica. A função da RNase P, nesse processo de maturação, é catalisar a reação de corte dessa sequência variável. Essa enzima é atípica pelo fato de ser constituída de duas subunidades, sendo uma de natureza proteica (pequena proteína de massa molecular de 20.000 daltons) e a outra é uma molécula de RNA, de 377 nucleotídeos. Admitia-se que a atividade catalítica da RNase P era dividida entre a subunidade nucleica e a subunidade proteica, esta assumindo uma atividade enzimática e o RNA um papel estrutural. Em 1983, o grupo de Sydney Altman da Universidade de Yale, em Connecticut, em colaboração com a equipe de Norman Pace, em Denver, observaram que em certas condições in vitro, o RNA dessas enzimas era capaz de efetuar a reação em questão, cortando o precursor do RNAt no lugar correto em ausência de proteínas. Estas, por outro lado, não têm ação sem o RNA. É provável, entretanto, que a proteína, desprovida, ela mesma, de atividade catalítica, ajude o RNA a funcionar nas condições naturais da célula. No ano seguinte, graças a trabalhos, ainda, realizados pelo grupo de Altman, essa hipótese de que a atividade catalítica da RNase P reside na fração nucleica foi confirmada. Dessa feita, foi efetuada a transcrição do RNA da ribonuclease P a partir de um DNA recombinante, tendo sido demonstrado que esse RNA artificial catalisava a maturação normal dos precursores do RNAt. Eliminando-se, assim, a eventualidade de uma catálise por uma proteína contaminante, essa experiência demonstrou que, pelo menos in vitro, a parte catalítica da RNase P é representada pelo RNA. In vivo, entretanto, não existe nenhuma prova que a subunidade nucleica sozinha seja capaz de catalisar a maturação dos precursores do RNAt. A subunidade proteica é certamente necessária para o funcionamento in vivo da RNase P. Ela atua aumentando a velocidade da reação, estabilizando a estrutura do RNA e modificando a especificidade da enzima. Acessoriamente, ela atua, ainda, protegendo a subunidade nucleica contra a degradação pela RNase T1, principalmente dos nucleotídeos entre as posições 170 e 270. Pela descoberta dos RNAs catalíticos Altman recebeu, juntamente com Cech, o prêmio Nobel de química 1989.

Os íntrons autocatalíticos e a RNase P não são os únicos sistemas RNA dotados de atividade catalítica. Em 1986 uma terceira categoria foi descoberta em RNAs associados a vírus de plantas, os chamados RNA satélites. Alguns vírus vegetais apresentam, além do seu próprio RNA genômico, moléculas de RNA suplementares que utilizam os mecanismos de disseminação e de multiplicação do vírus, em seu próprio benefício. Esses RNAs satélites atingem concentrações elevadas nas células infectadas e se comportam, em alguns casos, como moléculas parasitas dos vírus, atenuando a severidade dos sintomas induzidos por esses agentes infecciosos. Durante sua multiplicação, alguns desses RNA satélites se encontram sob as formas circular e linear. As cadeias lineares podem se apresentar com uma única sequência ou conter um grande número de unidades idênticas justapostas. George Bruening e colaboradores da Universidade da Califórnia, em Davis, estudaram as formas diméricas (constituídas por dois monômeros) do RNA satélite de um vírus parasita do tabaco. Eles mostraram, em 1986, que essas moléculas diméricas podiam catalisar sua própria clivagem, liberando os dois RNAs satélites monoméricos.

RIBOZIMA EM “CABEÇA DE MARTELO”

Comparando os domínios catalíticos de vários RNA satélites e de um viroide, uma outra família de agentes patogênicos de plantas, A. Forster e R. Symons, da Universidade de Adelaide, na Austrália, mostraram que eles apresentavam uma estrutura típica constituída de um dobramento em “cabeça de martelo” (hammerhead) – uma das ribozimas estruturalmente mais simples que se conhece. São conhecidos vários domínios catalíticos diferentes que apresentam essa estrutura, distribuídos não apenas entre os vegetais, mas também entre os animais, como no caso da salamandra. A principal característica desse terceiro grupo de RNA catalítico é seu pequeno tamanho. Cerca de 50 a 60 nucleotídeos são suficientes para a catálise in vivo, o que é, sem dúvida, pouco quando comparado aos íntrons do grupo I, por exemplo, que devem conter no mínimo 180 nucleotídeos. A ribozima em “cabeça de martelo”, nome derivado da sua conformação bidimensional, que se assemelha à referida ferramenta, forma com seu substrato (figura a seguir) uma estrutura bidimensional particular em forma de T (ribozima em T), compreendendo 3 regiões em dupla hélice (I, II e III) e regiões consensuais (não variáveis) em 5′ e 3′ da ribozima. As dupla hélices I e III, de sequências variáveis e formadas entre a ribozima e seu substrato, são importantes para o posicionamento do sítio de clivagem. A hélice II, ao contrário, é intrínseca à ribozima.

11.RIBOZ

Em 1992 McCall e colaboradores conseguiram reduzir o tamanho dessa ribozima ao estado de uma mini-ribozima ativa, pela eliminação da hélice II. Essa mini-ribozima representa um excelente modelo para estudar a estrutura e o mecanismo dessa enzima RNA, bem como pode ser utilizada visando uma aplicação terapêutica. A substituição de um resíduo nas regiões consensuais da ribozima, que contém 13 nucleotídeos (ver figura anterior), reduz ou suprime a atividade catalítica. Utilizando um sítio ativo consensual deduzido da sequência de ribozimas virais, pode-se clivar, teoricamente, um RNA em posição pré-determinada. Essa clivagem que é dependente de íons divalentes libera um fragmento 5′ com uma extremidade 2′,3′ fosfato cíclica e um fragmento 3′ com uma extremidade 5′ OH (figura abaixo).

12.ABAI

No caso dos sistemas artificiais em “cabeça de martelo”, o único imperativo, em relação ao substrato, é a presença de um terno GUX (X diferente de G) em 5′ do sítio de clivagem. Da mesma forma que os íntrons da Tetrahymena, esses RNA naturais em “cabeça de martelo” não são verdadeiras enzimas, na medida em que eles não clivam a não ser sua própria molécula. A partir 1987, época em que Olke Uhlenbeck da Universidade do Colorado conseguiu pela primeira vez distinguir a parte catalítica e a parte substrato, tornou-se possível conceber ribozimas em “cabeça de martelo” compostas unicamente do domínio catalítico e capazes de clivar outros RNAs. Surgiram então as regras para concepção de novas enzimas artificiais à RNA, cujo princípio básico é fabricar uma ribozima contendo a região catalítica modificada para reconhecer uma outra molécula de RNA. O funcionamento, in vitro, de ribozimas artificiais em “cabeça de martelo” dirigidas contra diversos RNAs se tem reveladoeficaz. In vivo, apesar de promissores, os resultados obtidos ainda são embrionários.

RIBOZIMA EM “GRAMPO DE CABELO”

Os RNAs satélites são também a fonte de um outro tipo de ribozima que possui uma estrutura em “grampo de cabelo” (hairpin), cujo mecanismo de clivagem é idêntico ao descrito para o sistema em “cabeça de martelo”. Em 1989, a equipe de Arnold Hampel da Universidade de Northern Illinois conseguiram separar a parte substrato e a parte enzima da cadeia negativa do RNA satélite do Tobaco ringspot virus [(-)sTRSV], mostrando que a ribozima assim obtida, era capaz de clivar outras moléculas de RNA, como fora feito em relação à ribozima em “cabeça de martelo”.

A ribozima em “grampo de cabelo” (figura a seguir) forma com seu substrato, uma estrutura bidimensional composta de 4 regiões em dupla hélice (I, II, III e IV) e duas regiões em arco, uma entre as hélices I e II e outra entre as hélices III e IV. As hélices I e II, com respectivamente 6 e 4 pares de bases, são formadas entre o RNA substrato e o RNA catalítico, que apresentam 14 e 50 nucleotídeos, respectivamente. As hélices III e IV, ao contrário, são intrínsecas à ribozima. A partir de 1990 um grande número de trabalhos tem sido feito visando conhecer as bases nitrogenadas que são requeridas dentro do complexo enzima-substrato do sistema dito em “grampo de cabelo”, visando produzir enzimas artificiais capazes de clivar RNAs alvos heterólogos. Considerando o conjunto dos trabalhos já publicados, constata-se que o único imperativo, em nível do substrato, é a presença de uma guanosina em 3′  do sítio de clivagem (figura a seguir).

12.SEG

Com o objetivo de conhecer a estrutura da ribozima em “grampo de cabelo” complexada ao seu substrato, nós estudamos as interações ribozima-substrato a partir de análogos DNA não cliváveis do substrato. Esses análogos já tinham sido utilizados por Heus e Pardi, em 1991, para estudar a estrutura secundária do domínio catalítico em “cabeça de martelo”. Nosso trabalho, desenvolvido no Laboratório de Fotobiologia Molecular do Instituto Jacques Monod da Universidade Pierre et Maria Curie (Paris VI) foi realizado utilizando uma técnica de marcação por fotoafinidade intrínseca dos ácidos nucleicos, em que resíduos do DNA ou RNA estudado são substituídos por análogos de bases fotoativáveis especificamente. Como sonda de fotoafinidade intrínseca introduzimos, em posições específicas, nos análogos DNA não cliváveis do substrato, a 4-thiouridina (S4U) e a 6-thioinosina (S6I). A 4-tiouridina é um análogo tiolado da uridina que pode substituir a uridina ou a timidina, enquanto a 6-thioinosina e um análogo tiolado da inosina que pode ser utilizada em lugar da guanosina. Essas substituições não interferem, de modo significativo, no metabolismo celular.

Excitando essas sondas com ultra-violeta (UV), elas podem formar ligações có-valentes (pontes) intra ou intermolecular (figura abaixo).

14.AB;SITIO

A determinação da posição dessas pontes, através de sequenciamento do RNA catalítico (figura a seguir), nos permitiu, graças aos dobramentos tridimensionais, demonstrar a proximidade, no espaço, de resíduos afastados na sequência.

15.SEQ.ELETOs resultados mostrados na figura abaixo evidenciam uma grande flexibilidade, indicada pelas pontes, da região em arco situada entre as hélices I e II, onde se encontra o sítio de clivagem, mostrando que essa região exerce um importante papel na atividade catalítica do sistema em “grampo de cabelo”.

16.CABELOOUTROS RNAs CATALÍTICOS

Outros RNAs autocatalíticos foram descobertos e a lista não para de aumentar. Um deles foi descrito no RNA genômico do vírus da hepatite delta (HDV), cuja ribozima ativa é composta de 130 nucleotídeos. O HDV é um vírus satélite formado de um RNA circular, composto de 1700 nucleotídeos e associado ao vírus da hepatite B (HBV). Ele pode superinfectar os portadores da HBV (mamíferos, inclusive homem) e produzir uma forma severa de hepatite. RNAs autocatalíticos foram identificados também em Saccharomyces cerevisae, em Neurospora crassa e em mamíferos (ratos, cavalos e ornitorrinco, entre outros). Certamente, novas ribozimas serão descobertas em um futuro muito próximo, seja nas células vivas, seja através de síntese química.

POTENCIAIS APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS DAS RIBOZIMAS

Saída da mais pura pesquisa fundamental, as ribozimas suscitam hoje um grande interesse em razão de suas numerosas aplicações potenciais. De início, elas podem ser consideradas como preciosas ferramentas de laboratório para uso em engenharia genética. As ribozimas podem cortar RNAs em fragmentos precisos, de modo análogo ao que fazem as famosas enzimas de restrição, verdadeiras “tesouras” dos DNAs e pedra fundamental de todas as técnicas da engenharia genética. A mais importante utilização das ribozimas, entretanto, é a sua capacidade de inativar um RNA alvo escolhido dentro de uma célula, desde que elas sejam convenientemente manipuladas. Dessa forma, pode-se modificar a expressão de genes de animais ou de plantas transgênicas nas quais tenhamos introduzido o gene correspondente à ribozima em questão, como no caso dos oncogenes que intervêm na cancerização de células. Pode-se ainda, utilizando-se as ribozimas, tornar as plantas cultiváveis resistentes aos vírus RNA, que as atacam frequentemente. O desenvolvimento de vetores apropriados, capazes de transportar as ribozimas até o interior das células, permitirá também o emprego, diretamente, desses RNAs enzimas como medicamentos antivirais em saúde animal e humana, notadamente na luta contra os retrovírus, como no caso do vírus da AIDS. Pesquisas estão sendo feitas nessa direção. O maior obstáculo, entretanto, é a passagem de experiências in vitro, com os RNAs em tubo de ensaio, à célula viva, via o organismo inteiro.

A primeira prova de atividade ribozímica dentro de uma célula viva foi obtida em 1989, por Matt Cotten e Max Birnstiel do instituto de pesquisa e de patologia molecular de Viena. Esses pesquisadores injetaram em células gigantes (os oócitos) de um anfíbio, o xenopus, uma ribozima construída para clivar um RNA presente no interior da célula. O RNA em questão desapareceu da célula após a injeção. No mesmo ano, Fiona Cameron e Phil Jennings do CSIRO (Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation), em Sydney, introduziram simultaneamente nas células de macacos, em cultura, dois genes: um dirigido para a síntese de uma ribozima e um outro dirigido para a produção da chloramphenicol acetyl transferase, enzima de fácil dosagem. A ribozima tinha por alvo o RNA mensageiro dessa enzima. Como era de se esperar, a atividade da enzima em foco foi significativamente reduzida pela presença da ribozima.

Outros resultados interessantes foram obtidos a partir de pesquisas visando a inativação de oncogenes celulares e de retrovírus, como o vírus da AIDS. Em 1991, Kevin Scanlon e colaboradores do City of Hope National Medical Center, na Califórnia, mostraram que uma ribozima era capaz de inativar um proto-oncogene celular. Em 1990, Sarver e colaboradores do National Institutes of Health, dos Estados Unidos, obtiveram a expressão estável, dentro de células humanas, de uma ribozima destinada a destruir o RNA dirigente da síntese de uma proteína do vírus da AIDS, a proteína gag. Quando essas células foram infectadas pelo vírus, uma redução do nível da expressão do RNA viral codante para essa proteína foi observada. Em 1993, nós construímos uma ribozima em “grampo de cabelo” (ribozima em L anti-HIV) capaz de clivar, in vitro, um RNA substrato, de 14 nucleotídeos, derivado de uma região consensual do HIV (figura a seguir).

17.HIVApesar da fraca atividade dessa ribozima construída, em relação ao análogo não modificado (“selvagem”), complexada com o substrato “normal” (figura a seguir),  o resultado sugere que as ribozimas em “grampo de cabelo” podem vir a ser usadas para inibir uma etapa do ciclo viral, reduzindo, portanto, a capacidade de replicação do HIV.

18.FRACA

Resta, entretanto, um grande caminho a percorrer para obter ribozimas destrutoras de RNA, utilizáveis em terapêutica, no nível de organismo inteiro. Para isto, é preciso, de um lado, aumentar sua atividade catalítica e, do outro, liberá-las precisamente nos órgãos ou nos tecidos, onde se exprime o gene a ser inativado. Uma forma de aumentar a atividade catalítica de um RNA dentro da célula é melhorar sua estabilidade, desde que os RNAs são em geral moléculas frágeis, facilmente degradáveis, tanto no interior das células, quanto no meio extra-celular. Uma das estratégias que pode ser utilizada consiste em introduzir a ribozima no seio de uma molécula de RNA, que nós sabemos mais estável. Isto pode ser feito, por exemplo, utilizando um RNA circular, como um derivado do íntron da Tetrahymena, ou ainda um RNA transportador. Pode-se, dessa forma, construir ribozimas com um esqueleto molecular modificado para ser resistentes às enzimas de degradação. Elas podem, também, ser “desenhadas” para alvos específicos de transcrição gênica (RNAm e RNAhn), de modo a clivar esses RNAs com fins terapêuticos. Igualmente, as ribozimas abrem possibilidades para o desenvolvimento de novas drogas e novas formas de terapia gênica, como o tratamento de agentes infecciosos, através do uso de fagos ou de outros vetores de clonagem.

RIBOZIMAS E ORIGEM DA VIDA (“O MUNDO DO RNA”)

Além de todas essas aplicações práticas, a descoberta das ribozimas provocou, também, novas perspectivas nas especulações sobre a origem da vida na terra. Os biologistas sempre especularam sobre um velho problema: a eterna questão “do ovo e da galinha”. De um lado, os ácidos nucleicos são o suporte das informações genéticas, que comandam a síntese proteica. De outro lado, a leitura dessas informações genéticas, bem como sua cópia, dependem da presença de enzimas “proteicas”. Isso significa que os ácidos nucleicos, moléculas “informacionais”, não podem existir sem as proteínas, moléculas catalíticas (ou efetuadoras) e vice-versa. A descoberta das ribozimas vem romper esse aparente paradoxo, desde que o RNA parece ser a única molécula dotada de capacidades informacional e catalítica. Essa ideia que o RNA pudesse ter sido o primeiro material genético, já proposta na década de 60 por Leslie Orgel do Instituto Salk da Califórnia, foi consolidada por Walter Gilbert em 1986. Atualmente o RNA aparece como o melhor candidato a ter sido um sistema primitivo de auto-replicação, sobre o qual a evolução darwiniana teria intervindo ao nível molecular. O fato de as ribozimas poderem se comportar, também, como polimerases capazes de alongar um RNA utilizando uma molécula modelo, sugere que, por ocasião da evolução das primeiras formas de vida, um sistema de replicação tendo por base unicamente o RNA tenha podido funcionar. Tendo função catalítica, além da de armazenador de informações genéticas, os RNAs podem ter funcionado sem DNA nem proteínas, quando a vida apareceu sobre a terra. Os erros (mutações) que ocorreram por ocasião das cópias dessas moléculas, teriam sido integradas às moléculas-filhas e posteriormente selecionadas. Os RNAs, em face de sua propriedade autocatalítica, teriam podido se multiplicar mais rapidamente que outras moléculas e invadido a população, até o aparecimento de novos mutantes mais eficazes. A descoberta que as enzimas RNA podem também catalisar reações químicas sobre as proteínas, vem reforçar essa hipótese de um RNA pré-biótico e aumentar ainda mais o campo de aplicações possíveis das ribozimas. Dessa forma, as ribozimas dispensaram a presença de proteínas no mundo pré-biótico. Sua descoberta originou um novo paradigma da origem da vida, denominado mundo do RNA, que precedeu o mundo atual baseado no DNA e proteínas.

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Responses

  1. Djalma, envie seu telefone para comunicação.
    Wilson(esuda)

    • Caro Wilson Barreto
      Telefones enviados via Email
      Abraços
      Djalma Santos

  2. Olá professor djalma..tudo bom?
    Frequento a um tempo o teu blog , e percebo a qualidade dele nos posts.. e hoje é a primeira vez que eu comento

    bem, crie recentemente um fórum de auxílio a biologia e química para alunos de ensino médio e vestibulandos..
    O fórum consistem em troca de aprendizados em que cada membro pode ensinar , auxiliando nas dúvidas teóricas

    Gostaria muito que o senhor fizesse parte, pois assim enriqueceria nosso fórum com o seu conhecimento…

    http://bioquimica.forumeiros.com/

    Abraços!

    • Caro Felipe
      Enviei uma resposta para o seu e-mail.
      Abraços
      Djalma Santos

  3. Muito bom, altíssima qualidade, valeu professor

    • Caro Antônio
      Obrigado pelo comentário. Disponha do nosso blog. Ribozma foi o tema da nossa tese de Doutorado (Conformation et activité catalytique des ribozymes en “épingle à cheveux”) desenvolvida na Université Pierre et Marie Curie (Paris VI).
      Um forte abraço
      Djalma Santos


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